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DOENÇAS INFECCIOSAS - IMUNOLOGIA CLÍNICA E BIOLOGIA MOLECULAR (PCR)

Doença Infecciosa é qualquer doença causada por patógenos como bactérias, fungos, protozoários, vírus, parasitas ou príons, que podem ser transmitidas de um hospedeiro para outro.

Na rotina laboratorial, praticamente todos os exames podem contribuir para o diagnóstico de doenças infecciosas, seja através de exames diretos ou indiretos.

A Imunologia Clínica investiga e orienta o clínico quanto à presença de patógenos através de métodos diretos ou indiretos.
Os exames diretos visam identificar a presença do agente (ou antígeno) na amostra, enquanto que exames indiretos irão detectar produtos do patógeno, como toxinas, ou substâncias que demonstrem a resposta do hospedeiro ao agente, caracteristicamente através da produção de anticorpos pelo sistema imune.

Os testes sorológicos ou imunoensaios apresentaram evidente evolução nas últimas décadas, sendo desenvolvidos diversos métodos sensíveis para a detecção e/ou quantificação de antígenos ou anticorpos. Esses testes possuem diferentes complexidades, sensibilidades e especificidades para diagnóstico.
Os exames envolvem reações de precipitação, como a imunodifusão; técnicas de separação eletroforética, como a imunofixação; reações da aglutinação; ensaios líticos, como a fixação de complemento; imunofluorescência, que se vale de marcadores fluorescentes; ensaios com marcadores radioativos, como radioimunoensaio, enzaios luminescentes, como a quimioluminescência; e ensaios com marcadores enzimáticos como o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

A Reação de Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é uma técnica de biologia molecular desenvolvida no final da década de 80 por Kary Banks Mulis e baseia-se na síntese enzimática in vitro de cópias de fragmentos específicos de DNA ou RNA. A partir de uma única molécula é possível reproduzir milhares de cópias, permitindo diversas análises.
Tem sido amplamente utilizada em infectologia clínica para o diagnóstico de infecções virais e bacterianas, em situações nas quais o isolamento dos agentes é muito difícil ou impossível, e independe da viabilidade do microrganismo, pois detecta sequências dos ácidos nucléicos específicos dos patógenos.

O PCR em Tempo Real (Real-Time PCR) ou qPCR (quantitative PCR) foi uma evolução da metodologia convencional. Caracteriza-se como uma técnica semi-quantitativa, com alta sensibilidade e obtenção de resultados em tempo menor, pois a quantificação ocorre durante o processo de amplificação do material genético.

O LAB&VET oferece testes imunológicos e RT-PCR para o diagnóstico de diversas doenças infecciosas que acometem os animais domésticos.
A opção por um exame ou outro dependerá do interesse do parceiro Clínico Veterinário diante dos quadros apresentados por seus pacientes.
Nas tabelas abaixo estão especificadas as doenças, bem como os possíveis métodos para pesquisa dos agentes ou detecção de anticorpos produzidos em resposta a eles.

LEGENDAS
IC	Imunocromatografia
IGDA	Imunodifusão em Ágar Gel
IFD	Imunofluorescência Direta
RIFI/IFA	Imunofluorescência Indireta
HI	Hemoaglutinação Indireta
SN	Soroneutralização
AM	Aglutinação Microscópica
PB	Prova Biológica
ELISA	Ensaio de Imunoabsorção Enzimática
IT	Imunoturbidimetria
qPCR	Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

ESPÉCIE CANINA

DOENÇA INFECCIOSA	MÉTODO		MATERIAL	RESULTADO
4 DX - Anaplasmose, Dirofilariose,              Ehrlichiose e Doença de Lyme	ELISA		Soro*	24/48 h
Adenovirose Canina	qPCR – Adenovirus Canino Tipo II		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Anaplasmose Canina	qPCR – Anaplasma platys		Sangue em EDTA**, Punção de Medula Óssea	Até 4 dias
Avaliação Vacinal	sorologia		Soro*	3 dias
Babesiose Canina	ELISA - Titulação de IgG		Soro*	10 dias
	ELISA - Titulação de IgM		Soro*	10 dias
	qPCR - Babesia canis		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Bartonelose	qPCR - Bartonella sp		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Bordetelose Canina	qPCR – Bordetella bronchiseptica		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Brucelose canina	IDGA - Brucella canis		Soro*	24/48 h
	qPCR - Brucella spp		Sangue em EDTA**, Urina***, Sêmen	Até 4 dias
Campilobacteriose	qPCR – Campylobacter coli		Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
	qPCR - Campylobacter jejuni		Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
Clamidiose	qPCR – Chlamydophila psittaci		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Cinomose	IC - Antígeno		Soro*, Urina***, Swab de Conjuntiva	24/48 h
	IC - Anticorpo (titulação)		Soro*	24/48 h
	qPCR – Vírus da Cinomose		Sangue em EDTA**,Urina***	Até 4 dias
Clostridiose	qPCR – Clostridium perfringens		Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
Coronavirose	qPCR – Coronavirus Respiratório		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
	qPCR – Coronavirus Entérico		Swab de Ampola Retal, Fezes****	Até 4 dias
Criptococose	qPCR – Cryptococcus spp		Líquor	Até 4 dias
Criptosporidiose	qPCR – Cryptosporidium spp		Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
Dirofilariose	qPCR – Dirofilaria immitis		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Erliquiose Canina	ELISA  - Anticorpo (titulação)		Soro*	24/48 h
	qPCR – Erlichia spp - Pool		Sangue em EDTA**, Punção de Medula Óssea	Até 4 dias
	qPCR – Erlichia canis		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Giardíase	ELISA - Antígeno		Fezes****	24/48 h
	qPCR – Giardia spp		Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
Hepatozoonose	qPCR – Hepatozoon canis		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Herpesvirose Canina	qPCR – Herpesvirus Canino		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Influenza Canina	qPCR – Virus da Influenza Canino		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Leishmaniose	IC/ELISA - titulação		Soro*	Até 10 dias
	RIFI/ELISA - titulação		Soro*	Até 5 dias
	qPCR – Leishmania spp		Sangue em EDTA**, Punção de Medula Óssea e Linfonodo	Até 4 dias
Leptospirose	AM - Anticorpo (titulação)		Soro*	Até 10 dias
	qPCR – Leptospira interrogans		Sangue em EDTA**, Urina***	Até 4 dias
Micoplasmose	qPCR – Mycoplasma haemocanis		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Neosporose	IFI - Anticorpo		Soro*	Até 10 dias
	qPCR – Neospora caninum		Líquor	Até 4 dias
Parainfluenza Canina	qPCR – Virus da Parainfluenza		Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Parvovirose	ELISA – Antígeno		Fezes****	24/48 h
	qPCR – Virus da Parvovirose		Sangue em EDTA**,   Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
Raiva	IFD e PB - (diagnóstico)		Cérebro	24 h e 12 dias
	SN - Anticorpo (titulação)		Soro*	45 dias
Rangeliose	qPCR – Rangelia vitalii		Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Salmonelose	qPCR – Salmonella spp		Swab de Ampola Retal	Até 4 dias
Toxoplasmose	RIFI - Diagnóstico		Soro*	Até 10 dias
	qPCR – Toxoplasma gondii		Swab de Ampola Retal, Líquor	Até 4 dias
Tripanossomíase	qPCR – Trypanosoma spp		Sangue em EDTA**	Até 4 dias

ESPÉCIE FELINA

DOENÇA INFECCIOSA	MÉTODO	MATERIAL	RESULTADO
Bordetelose Felina	qPCR – Bordetella bronchiseptica	Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Calicivirose	qPCR – Calicivirus Felino	Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Clamidiose	qPCR – Chlamydophila felis	Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Coronavirose Entérica	qPCR – Coronavirus Entérico Felino	Fezes****, Swab de Ampola Retal	Até 4 diass
Citauxoonose Felina	qPCR – Cytauxzoon felis	Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Erliquiose Felina	qPCR – Erlichia spp - Pool	Sangue em EDTA**, Punção de Medula Óssea	Até 4 dias
Esporotricose	Sorologia	Soro*	Até 5 dias
FeLV - Leucemia Viral Felina	ELISA	Soro*	24/48 h
	qPCR – Virus da Leucemia Felina	Sangue em EDTA**	Até 4 dias
FIV - Imunodeficiência Viral Felina	ELISA	Soro*	24/48 h
	qPCR – Virus da Imunodeficiência Felina	Sangue em EDTA**	Até 4 dias
FIV/FeLV	ELISA	Soro*	24/48 h
Giardíase	IC	Fezes****	24/48 h
Herpesvirose Felina	qPCR – Herpesvirus Felino	Swab de Conjuntiva e Swab Faríngeo Profundo	Até 4 dias
Micoplasmose Felina	qPCR – Mycoplasma haemofelis	Sangue em EDTA**	Até 4 dias
	qPCR – Mycoplasma haemominutum	Sangue em EDTA**	Até 4 dias
	qPCR – Mycoplasma turicencis	Sangue em EDTA**	Até 4 dias
Leishmaniose	IC - Diagnóstico	Soro*	Até 10 dias
Peritonite Infecciosa Felina (PIF)	ELISA	Soro*	24/48 h
	qPCR – Coronavirus felino	Efusão	Até 4 dias
Toxoplasmose (diagnóstico)	IC	Soro*	Até 10 dias
Tricomoníase Felina	qPCR – Tritrichomonas foetus	Swab de Ampola Retal, Fezes****	Até 4 dias

*SORO (frasco com tampa vermelha ou amarela)

- Colher por punção venosa no mínimo 3,0 ml de sangue. Este procedimento deve demorar no máximo 2 minutos.
- Quando utilizada seringa, abrir a tampa do tubo, retirar a agulha da seringa e transferir o sangue para o tubo deixando-o escorrer pela parede do frasco.
- Manter refrigerado (2- 8ºC).


**SANGUE EM EDTA (frasco com tampa roxa)


- Colher por punção venosa de 1 a 3 ml de sangue (o volume colhido pode variar conforme o tamanho do frasco disponível). Este procedimento deve demorar no máximo 1 a 1,5 minutos.
- Para contagem de plaquetas utilizar frasco plástico com EDTA. Quando utilizada seringa, abrir a tampa do tubo, retirar a agulha da seringa e transferir o sangue para o tubo deixando-o escorrer pela parede do frasco
- Este procedimento deve demorar no máximo 1 a 1,5 minutos.
- Para contagem de plaquetas utilizar frasco plástico com EDTA.
- Quando utilizada seringa, abrir a tampa do tubo, retirar a agulha da seringa e transferir o sangue para o tubo deixando-o escorrer pela parede do frasco.
- Tampar e homogeneizar por inversão por no mínimo 30 segundos.
- Acondicionar as extensões secas em porta-lâminas bem fechado, em temperatura ambiente.
- Manter a amostra de sangue com EDTA refrigerada (2- 8ºC).


***URINA (tubo cônico, coletor universal ou seringa)
- Colher amostra de urina preferencialmente com sonda ou por cistocentese, ou ainda por micção espontânea após anti-sepsia de vulva/prepúcio e desprezando os primeiros jatos. Colocar no coletor ou deixar na seringa.
- Refrigerar imediatamente (2- 8ºC).
Volume indicado: 10ml. Excepcionalmente são aceitos volumes inferiores.


****FEZES (coletor universal plástico)
- Colher amostras de fezes frescas, recém eliminadas em frasco limpo e refrigerá-las imediatamente.
- Amostras muito líquidas podem ser colhidas do piso com o auxílio de seringa. A amostra também pode ser colhida diretamente do reto.
Quantidade: 10 a 20 g ou 10 a 20 ml.


REFERÊNCIAS

BENDER, A.L.; Von MUHLEN, C.A.Testes laboratoriais aplicados à imunologia médica. In: VOLTARELLI, J.C.; DONADI, E.A.; CARVALHO, I.F.; ARRUDA, L.K.; LOUZADA Jr, P.; SARTI, W. Imunologia na Clinica Médica. São Paulo: Atheneu.2009. cap.5, p. 77- 98. Disponível em: < https://www.sobrau.com/wp-content/uploads/2016/11/Testes-Laboratoriais-Aplicados-Imunologia-Clinica.pdf >. Acesso em: 27 Set. 2019.

FONSECA, G.R.; LESCANO, S.A. Z.; PAULA, F. M.; CORRAL, M.A.; MELO, G.B.;FONSECA, P.D.M.; SANTOS, S.V.; CHIEFFI, P.P.; GRYSCHEK, R.C.B. Toxocaríase murina experimental: comparação do diagnóstico molecular e imunológico. The Biologist (Lima), v.16, Supl. Esp.1, p.22, 2018.

HAAS, D.J.; TORRES, A.C.D. Aplicações das técnicas de PCR no diagnóstico de doenças infecciosas dos animais. Revista Científica de Medicina Veterinária, Ano XVI, n.26, jan. 2016. Disponível em: < https://www.researchgate.net/profile/Dionei_Haas/publication/321951849_Aplicacoes_das_tecnicas_de_PCR_no_diagnostico_de_doencas_infecciosas_dos_animais/links/5a3af118a6fdcc7ffe63f323/Aplicacoes-das-tecnicas-de-PCR-no-diagnostico-de-doencas-infecciosas-dos-animais.pdf >. Acesso em: 27 Set. 2019.

Soro*